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免疫組化技術(shù)與Western blotting、ELISA的異同、ELISA類型
1)Western blotting
蛋白質(zhì)免疫印跡，也是利用抗體抗原反應(yīng)原理，結(jié)合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來(lái)檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測(cè)方法。與免疫組化技術(shù)相比，定量可能更加準(zhǔn)確;當(dāng)然Western blotting也可定性和定位(通過(guò)提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測(cè)其中抗原含量，進(jìn)而間接反映它們的定位)，但敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)。
2)ELISA
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，也是利用抗體-抗原-抗原結(jié)合反應(yīng)原理來(lái)檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測(cè)。與免疫組化技術(shù)相比，定量準(zhǔn)確，是分泌性蛋白檢測(cè)選方法之一。
(一)雙抗體夾心法
雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原常用的方法，操作步驟如下：
(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
(2)加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
(3)加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
(4)加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。
(二)雙位點(diǎn)一步法
在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步(圖15-5)。這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hookeffect)，類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
(三)間接法測(cè)抗體
間接法是檢測(cè)抗體常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
(1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
(2)加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過(guò)程中被洗去。
(3)加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測(cè)人對(duì)某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。
(4)加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。
本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。
(四)競(jìng)爭(zhēng)法
競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
(1)將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。
(2)待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)充分的量。洗滌。 (3)加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原多，故顏色深。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。
(五)捕獲法測(cè)IgM抗體
血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上，在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM。操作步驟如下：
(1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。
(2)加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
(3)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。
(4)加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。
(5)加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在，是為陽(yáng)性反應(yīng)。
(六)應(yīng)用親和素和生物素的ELISA
親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合。現(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素(strepavidin)。生物素(biotin)又稱維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素-羥基琥珀亞胺酯(biotin-hydroxysuccinimide，BNHS)可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就為穩(wěn)定。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來(lái)，就可大提高ELISA的敏感度。
親和素-生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大。可以在固相上先預(yù)包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合，通過(guò)親和素-生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。另外，在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素-酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號(hào)。
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